精子分析中基于CASA技术的应用指南（二）
三、仪器的基本使用方法
9、当仪器用于精浆中非获能精子运动分析时，CASA仪器的放大倍数的选择应遵循让大多数精子离开视野前跟踪录像0.5秒。因此对于人类精子分析，视野范围不少于200X200 um,这允许被跟踪精子直线速率平均值可以到达100um/s。
10、对于人类精子分析，物镜放大倍数是10倍、必须用上合适的孔径数值和提供足够聚光深度。
11、在活力分析中，数字化设备应有符合标准视频技术的最大分辨率。
12、在理想状况下，人类精子活力分析需要采集图像的频率为每秒50帧以上。
13、最少需要跟踪0.5秒是为了获取跟踪轨迹可靠的运动学数据值。CASA的参数值应为了尽可能随时达到这个目的而设置。如果一份样本中的数据包括很大比例的短轨迹，那么用户必须意识到这可能是他们对数据和结果的偏见造成的。如果使用更长的轨迹，必须通过排除快速运动离开视野范围的精子，通过排除额外快速运动进入视野采集窗口中的精子或者计数个体轨迹的分段作为多个轨迹的精子，且须说明排除后并不影响结果。
四、测定精子浓度
14、这不能成为获取CASA设备的基本原因。
15、如果用户希望用CASA仪器测量精子的浓度，那么他必须使预期的测量程序和已经存在且可靠的技术对比分析来提供准确的结果。
16、普遍认为现在这一代CASA仪器对于精子浓度的测量不能提供准确、可重复测量的值，除非能够通过特殊的染色方法从其他细胞和碎片中分辨出精子来。如定量的DNA荧光染色来测定原子核大小。
五、精子活动率的测量
17、这不能成为获取CASA设备的基本原因。
18、如果用于精液常规分析中，CASA应当确定逐渐运动精子的浓度。如果在精液样本的制备、仪器的使用、用户适当标准的定义中足够谨慎，CASA就能准确测量这个值。
不能依赖CASA仪器在跟踪活精子的同时区分细胞碎片和死精子，因此现在的CASA仪器不应用于精子存活率测定。
六、精子运动的测定
19、目前大家一致同意以下观点：(ⅰ)测量的精液样本浓度高于CASA仪器制造商推荐的浓度一定要用自身无细胞精浆稀释；(ⅱ) 所有的CASA分析在体温环境下进行，人类精子分析在37°C进行；(ⅲ) 一定要使用最小深度为10 um的计数板，深度大于20 um没有任何好处。(ⅳ) 每份精液样本至少分析200条活动的精子。
20、研究应承担发展出精浆中分离出的精子在人工培养基中精子运动学标准化检测的责任，以达到活动精子的浓度可以调整到CASA设备发挥最佳性能的目的。使用的培养基必须是非获能的。
21、因为推导非获能精子平均路径依赖于图像采集的帧率和单个精子的几何轨迹，所以强烈呼吁CASA设备制造商开发允许适当的平滑化处理每个精子运动轨迹的软件。
22、无论是在精浆中还是在标准试验培养基中，同一类精子运动学平均数值被认为价值有限。这是因为值通常不是正态分布，使样本平均值不能准确估计样本。因此(ⅰ) 中位数、范围或者百分位数都被认为比平均值更有意义。(ii) 应该做出多参数运动学定义。定义将允许将每个精子按照相关功能分界端点分为不同的种类（例如穿透力强的精子）。
对于临界值的分析，建议每个轨迹数据值保存在数据库中。无论从样本描述或和其他样本对比时选择最合适的统计学方法，以便检查它们的分布情况。
23、强烈呼吁CASA的设备制造商发展更加智能重建轨迹的软件。特别是矢量跟踪解决令人困惑的轨迹，例如那些相互碰撞精子产生的轨迹，离开视野/进入视野错误结合在一起的复合型轨迹。虽然不可能消除对仪器的依赖，但这将在一定程度上减少检测浓度时对CASA仪器的依赖。
七、CASA分析超活化精子
24、在识别超活化精子中平均时间运动学数据测量要特别小心。本文建议现代化的研究应专注于无维度的、独立机器的运动测量模型。
25、精子超活化研究准备液化的精液样本不应使用对精子功能有潜在危害的技术，例如最初从精浆中分离精子的离心法。
26、应采用一种适当的培养基，即它支持精子体外获能。然而培养基必须含有至少25 mM 碳酸氢根离子和一定数量的钙离子，还有葡萄糖。足够的蛋白质，至少需要10 mg/ml，要包含出现吸附玻璃现象的最小含量。
需要牢记的是含铁元素的介质在人类精子扩散培养中已被证明能促进形成活性氧（ROS）。
27、所有超活化分析必须在体温的环境中进行，如人类精子超活化分析在37°C。
28、一定要准备足够深度的计数板以保证不限制超活化精子的运动。对人类超活化精子分析，最小的计数板深度为30 um是必要的。尽管50 um也许是理想的深度，它只能在所选用光学系统解决这个深度聚焦问题后才能使用。
29、对于超活化运动的定义必须把图像采集频率考虑在内，并且使用已经被CASA仪器验证的运动学分类标准。
30、本文建议应发展与机器无关的精子运动测量标准：(ⅰ) 允许在CASA仪器和实验室之间更加容易对比分析。(ii) 把正常无超活化的模型和少见大量超活化模型之间的差异考虑在内
八、CASA形态学分析
31、现在这一代的CASA仪器没有足够的能力用特定方式分析人类精子形态学来满足常规临床应用。特别是，不能评估精子的中段和尾部区域（WHO指南中需要）被认为是主要的缺点。因此，在1992年出版的WHO版本中不支持CASA仪器在临床中评估人类精子形态。
32、在准备人类精子形态学分析中（包括制作和染色准备）应该发展一个优先使用CASA技术的标准化协议。
九、CASA的临床应用
33、在男性不育诊断中，要使用CASA首先应对病人进行适当的临床评估（包括临床病史和身体检查）。
34、目前，CASA应用于临床应首先有根据公认的WHO的指导原则建立的一个精子的基本概述。
35、临床医生应明白分析之前正确处理样本是获得有用信息的关键。这对所有的精液分析都很重要，不仅仅是CASA。因此禁欲时间和射精到检测时间间隔必须精确记录。
36、研究是必要的，用目前这一代的CASA系统解释：(ⅰ) 限制男性正常生育的精液质量；(ii) CASA变量和妊娠时间之间的关系；(ⅲ) CASA变量（尤其是超活化）和IVF结果之间的关系。
WHO5标准特点
十、CASA的生殖毒理学应用
37、在附睾和输精管的精子毒理学研究中，接受样本必须被稀释，其用户必须解释: (ⅰ) 稀释过程不能损伤精子；(ii)在分析过程中培养基用来支持精子持续正常运动；(ⅲ) )精子的浓度已经调整和控制到尽量减少拥挤产生假现象的浓度范围内。
38、显微镜放大倍数根据精子大小和速度来调整（对于比人类精子更大更快的大鼠精子，X4的物镜是最合适的），并且计数板的深度要允许精子无阻力的运动（计数板的深度大于40 um适合大鼠精子）。
39、用户必须验证仪器设置已经优化到能检测所有运动的精子。
40、用户必须验证图像采集在检测物种的体温环境下进行。
41、在制备啮齿类动物精液样本时，CASA可以用来确定精子运动百分比和缓慢运动的百分比。用户定义的阈值应根据控制样本中临界端点的分布来调整。
42、推荐使用永久保存样本的方法，例如视频或数码图片，这样数据在任何时候都可以重新核查,且当软件功能升级时有必要重新检测。视野应采取随机记录的方式以防止用户根据视频表现来选择或拒绝特定的视野。
43、新的用户应把它们的样本制备方法和得出的速率数据去与符合当前实践的文献中达到的最低标准做对比分析。