作者：王 牧  喻满霞 
摘要 临床上过敏原特异性IgE检测对于IgE介导的过敏性疾病的特异性诊断和防治具有重大的意义。目前常用的过敏原特异性IgE检测方法有体内和体外两大类，体内检测方法主要是皮肤试验，体外检测主要是血清学特异性IgE检测，其检测方法主要有RAST、荧光酶免疫测定、ELISA、免疫印迹法、化学发光法等。近来过敏原微阵列芯片技术被认为是最有前景的方法之一。随着基因组学和蛋白质组学等分子生物学技术的发展，过敏原组分诊断的应用将日趋广泛。
关键词 过敏原 皮肤试验 激发试验 过敏原特异性IgE
过敏是一类临床常见疾病，其中以IgE介导的过敏性疾病为最常见，包括哮喘、鼻炎、严重过敏反应、药物过敏、食物过敏、湿疹、荨麻疹和血管性水肿等。全球范围内包括发达国家和发展中国家过敏性疾病的患病率都在急剧上升，已经成为重大的社会卫生问题。据世界卫生组织WHO统计，全球有数亿人患有鼻炎，估计有3亿人有哮喘，且每年有25万人死于可以避免的哮喘1。
引起过敏反应的物质叫过敏原，亦称为变应原。防治过敏性疾病的关键在于发现过敏原并避免与之接触，或进行免疫治疗，因此过敏原特异性IgE（sIgE）检测是诊断和防治过敏性疾病的重要依据。
通常过敏原sIgE检测可以分为两大类：一类是体内试验，如皮肤试验、激发试验等；一类是体外试验，如血清学过敏原sIgE检测、嗜碱性粒细胞激活试验（BAT）等。如果按照过敏原sIgE的显示证据链，可分为反映sIgE直接证据的体外血清学过敏原sIgE检测和反映sIgE间接证据的皮肤试验和体外BAT等。又如根据过敏原制备的差异，又可以分为粗提取物试验和蛋白组分试验。
1 皮肤试验
用于过敏原sIgE检测的皮肤试验通常包括皮肤点刺试验和皮内试验。皮肤斑贴试验是用于辅助诊断迟发型细胞介导的过敏反应，与IgE介导的速发型过敏反应没有相关性。所有的皮肤试验，都需采用合适的阳性组胺对照和阴性对照以确认阳性或阴性试验结果的有效性。采用的阴性质控取决于所采用的过敏原提取物的溶媒2。如点刺液是过敏原的甘油生理盐水溶液，采用的阴性对照就应该是甘油生理盐水溶液。皮肤试验的优势就在于患者可以立刻知道自己对哪种过敏原过敏或者什么是引起他/她的症状的原因，而且与激发试验的相关性很好，尤其是皮肤点刺试验，但是可能有引起系统性反应或其他不适的风险。所以不是所有患者都愿意接受皮肤试验，而且有些患者也不适合做皮肤试验，如具有皮肤划痕症或者全身湿疹，又或者使用过抗组胺药等。此外，皮肤试验还有其他局限性，如皮肤试验用过敏原提取液标准化很难，不同厂家的过敏原提取液蛋白含量不同，批与批之间也会有很大差异，有些过敏原蛋白在提取过程中会缺失等3-5。因此，皮肤试验用的过敏原提取液的标准化和皮肤试验操作流程的标准化都非常有必要。
1.1 皮肤点刺试验
皮肤点刺试验（Skin Prick Test， SPT）可用于确认各种过敏原的临床敏感度，可以采用不同的器具不同的方法做6。SPT是一类表皮试验，将少量高度纯化的过敏原提取物溶液滴于患者前壁，再用点刺针或柳叶刀透过过敏原溶液轻轻刺入皮肤表层。然后一般15-20分钟后查看结果2,6。
研究显示，与金标准口服食物激发试验相比，食物SPT相当敏感，阴性预测值超过90%7。SPT阳性结果（风团直径超过阴性对照3mm8）仅是确认致敏，不能单独肯定诊断，不过风团直径越大，测试食物引起过敏反应的可能性增加，因此SPT结果应该评估风团大小，而不应仅仅是记录阴阳性。如Sporik和其同事9定义在儿童人群以下几种食物发生反应的皮肤点刺试验平均风团直径：牛奶>8mm；鸡蛋>7mm；花生>8mm。由于目前商业过敏原提取物尚无标准化，相对于吸入性过敏原提取物，一些食物蛋白不稳定，导致商业提取物组分不够，还是推荐使用新鲜食物做皮肤试验10。
使用SPT诊断过敏时，在使用前，必须停用对SPT结果有影响的药物，如第一代抗组胺药一般需要停用7天，第二代抗组胺药一般停用24小时，具有第一代抗组胺活性的抗抑郁药停用一周，SPT试验皮肤在试验前三周应该避免使用长效大剂量局部类固醇8。
1.2 皮内试验
皮内试验是把过敏原稀释溶液直接注射到患者真皮，通常在注射后10-15分钟观察结果。皮内试验比SPT更敏感，因为该方法过于敏感且有诱发全身性反应的风险，尤其是在食物过敏患者，目前已不建议用于食物过敏的诊断6。
通常也不采用皮内试验诊断呼吸道过敏，除非皮肤点刺试验阴性，或者是昆虫毒液过敏或者药物过敏8。
2 激发试验
激发试验是模拟自然发病条件，以少量过敏原引起一次较轻的变态反应发作，用于确定变应原的试验，它被认为是诊断过敏的金标准。根据患者发病部位的不同，可以进行不同器官的激发试验，常做的是支气管激发试验、鼻粘膜激发试验、结膜激发试验和口腔激发试验。由于其复杂性和危险性，尤其是吸入性激发试验，通常用于研究目的。但口腔激发试验常用于研究食物和药物过敏。
2.1 口服食物激发试验
自1976年口服食物激发试验（Oral Food Challenge，OFC）用于儿童，1982年用于成人诊断食物过敏后，双盲安慰剂对照食物激发试验（DBPCFC）被用作食物过敏的诊断金标准11,12。由于DBPCFC耗时，且耗费资源，所以许多病例有客观明确的反应时，开放的OFC足以诊断食物过敏。
如果观察到客观临床反应或使用了最终剂量没有观察到临床症状，通常应立即停止食物过敏激发试验。速发型反应通常出现在最后食物摄取后的2小时内，特应性湿疹可在口服激发试验后几小时或几天加重。荨麻疹和血管性水肿是最常见的客观体征，而胃肠道、呼吸道或心血管系统也常见累及。
为了优化安全性，进行OFC时应密切监测生命体征，设备和经过适当培训的人员应该到位，以便处理可能发生的过敏反应包括严重过敏反应。
3 体外检测
自1966年Ishizaka夫妇和S. Johannson同时发现免疫球蛋白E（IgE）后13,14，体外检测成为过敏诊断的一部分。过敏原特异性IgE抗体是诊断过敏性疾病确定个体过敏原暴露的最重要的血清学标志物。因此血清特异性IgE抗体测定是临床主要的体外检测手段15。其他体外检测有血清总IgE测定、细胞测定、血清胰蛋白酶、嗜酸性阳离子蛋白等。
3.1 总IgE测定
早期的一些研究已经对各种变态反应性疾病患者中总IgE的作用进行过评估，研究发现，在过敏性疾病患者中常出现总IgE水平升高的倾向，其中大约有60%患者总IgE水平在正常范围以上，但正常个体和过敏性疾病患者之间的血清总IgE水平有明显的交叉16,17。总IgE水平还受年龄、性别等因素影响18。因此总IgE水平测定有助于解释过敏原检测结果，但不能用来诊断过敏性疾病，更不能用来作为过敏原特异性诊断。虽然总IgE不能用于诊断过敏性疾病，但其是变应性支气管肺曲霉病（ABPA）的诊断标准之一19，且其对过敏性疾病的抗IgE治疗具有重要意义，是单抗药物剂量的选择依据20,21。
3.2体外过敏原sIgE测定
体外过敏原sIgE测定临床上主要见于血清过敏原sIgE检测，后者在过敏原体外检测中占有重要地位，被广泛使用，它是过敏原特异性诊断最可靠的方法之一。自Wide等人采用琼脂糖珠作为固相载体第一次体外测定特异性IgE22，后来开发了不同的固相载体甚至是可溶性系统测定特异性IgE。其基本原理就是采用竞争法或非竞争法测定形成的抗原抗体复合物的免疫测定。所有反应系统的共同点是其使用的过敏原要有患者待检血清中特异性IgE抗体所对应的特定抗原表位，并且要有足够且适当的抗人IgE的抗体。系统越好，可检测的sIgE抗体水平越低。可靠的厂家提供的系统应该确保反应结合的特异性，即只能检测IgE抗体，也只能检测到相应过敏原特异性IgE抗体，不会受其他不检测的抗体包括总IgE抗体干扰。高非特异性IgE水平不会导致阳性结果。
相对于皮肤试验，体外过敏原sIgE检测除了具有结果客观，重复性好，不受药物、皮肤等因素的影响，风险低等优点外，还可以通过过敏原抑制检查过敏原的特异性和交叉反应性。另外有些局部过敏反应只能采用体外过敏原sIgE检测，如检测鼻分泌物中的sIgE来诊断鼻局部sIgE升高带来的过敏症状，这类患者皮肤试验通常为阴性。
目前体外过敏原sIgE检测采用的主要是标记免疫分析技术，主要包括放射性标记免疫分析法、酶标记免疫分析法、荧光免疫标记分析法、化学发光免疫标记分析法、胶体金标记免疫分析法等，通过单一测试或者多重组合测试进行测定。
3.2.1 放射性过敏原吸附试验（RAST） RAST是最早使用的过敏原检测方法23，该方法敏感性、特异性和重复性均很高，易于自动化，在国外得到广泛应用。但因为该试验需要放射性同位素，价格昂贵，半衰期短，且易污染环境，2010年美国国家过敏及传染性疾病研究所（NIAID）/国立卫生研究院（NIH）建议停止采用RAST诊断过敏，用更敏感的免疫方法代替24。
3.2.2酶免法（EIA） EIA的特异性和敏感性与RAST相似，它除了有RAST的优点外，而且还相对价廉，无放射性污染，安全等特点。原理是过敏原吸附在微孔板或纸片上，当加入含有特异性IgE抗体的待测血清时，抗体便与相应的过敏原结合，再加入酶标记的抗人IgE抗体和相应底物，就可以显色测定血清特异性IgE的含量。通常用于过敏原特异性IgE的检测有间接法和捕获法，绝大多数过敏原体外检测系统采用间接法。
3.2.3金标免疫技术 金标免疫技术是以胶体金为标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。其优点是快速、简便、经济实用，稳定性好，其缺点是灵敏度不如酶标技术，一般作为定性，不易定量。临床上采用的是斑点金免疫层析试验，如ImmunoCAP Rapid，但由于是定性结果，临床应用受到一定的限制。
3.2.4免疫印迹法（IBT） IBT是在普通EIA基础上发展起来的新型技术，其特点是较ELISA特异性更高，目前主要见于德国敏筛过敏原等检测系统。其原理是将过敏原通过机器划线，非共价吸附于硝酸纤维膜上，更好地保留了过敏原蛋白的空间构象，其特点是可靠性高，特异性好。并融合了生物素亲和素放大系统，大大提高了反应的敏感度，可以进行微量的抗体检测，结果准确可靠。研究显示，其敏感度与皮试相近，并与CAP系统单项过敏原检测试验结果相符25。
3.2.5荧光免疫分析（FIA） FIA具有专一性强、灵敏度高、标记物不易失活、无放射性污染等优点。但一般荧光测定存在本底较高等问题，在一般荧光免疫测定技术上发展了一些新型检测技术，其中一种就是引入酶标记技术，如Phadia的CAP系统采用的就是荧光酶免技术，该系统是目前国际上获得较为广泛应用的过敏原体外定量检测系统。其主要原理是过敏原包被在经溴化氢活化的帽状纤维素衍生物载体上，后者与过敏原有极高的结合能力，标记β-半乳糖苷酶的抗人IgE抗体作用于4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷产生4-甲基伞酮发出荧光。CAP系统主要是定量检测过敏原提取物或过敏原组分，但近年有文献报道，由于其固相载体含碳水化合物抗原决定簇CCD结构，高达25%的患者可能出现假阳性情况26。
3.2.6化学发光免疫分析（CLIA） CLIA是将发光系统与免疫反应相结合，具有免疫反应的特异性，更具有发光反应的高敏感性，是继放免分析、酶免分析、 荧光免疫分析之后发展起来的新型免疫测定技术。目前采用该技术的有日立的MAST和西门子的IMMULITE 2000系统，不同于CAP系统，MAST系统是组合检测，一次同时半定量检测36种过敏原；IMMULITE 2000系统和CAP系统类似，可检测500多种过敏原，且可用于其它各种免疫分析检测，是一种通用化学发光免疫分析系统。新近美国Hycor推出的NOVEOS系统采用荧光磁微粒化学发光免疫法，一个测试只需要4μL血清，且不受CCD的干扰27。
3.2.7过敏原微阵列芯片法（Allergen-MicroArrays）微阵列芯片技术基础研究始于20世纪80年代末，从生物遗传学领域发展而起。微阵列技术是利用分子杂交的原理，用自动化仪器把不同的，数以百计、千计已知部分序列的DNA探针或蛋白质“印”在玻片或尼龙膜上而成阵列。主要是DNA芯片和蛋白质芯片。Wiltshiere等人第一次把该方法用于过敏原sIgE检测28。该方法较以往常规的检测技术，具有大通量、标本用量少、平行性检测等优点，使得同时检测上百种过敏原蛋白成为可能，被视为是最有前景的诊断工具之一，尤其适用于小儿过敏的诊断。目前国际上已有若干家过敏原检测产品采用该方法，但广为接受的就是瑞典Phadia的ImmunoCAP ISAC。基于生物芯片的优点，目前也有很多厂家或组织尝试研发不同类型的生物芯片技术用于sIgE检测，如Feyzkhanova等人研发的水凝胶生物芯片60ul血清可以测定21种过敏原sIgE和总IgE，测定结果与德国Fooke的酶免试剂盒测定结果具有很好的相关性29；Christian Lupinek等人介绍了欧洲研究项目—MeDALL过敏原芯片，这是相较上述ImmunoCAP ISAC更先进成熟的技术平台，可以检测将近170种过敏原分子的IgE，具有很好的敏感度和特异性，适用于过敏研究、过敏的精确诊断、疾病的监测、以及疗效的监测等30。目前具有最大检测通量的也是最新的微阵列芯片检测是奥地利的FABER测试，可检测将近300种过敏原提取物或分子的特异性IgE。但是，由于很多过敏原蛋白及过敏原组分尚未经过临床评价，微阵列芯片法目前还不适用于过敏性疾病的常规诊断。
不过，目前过敏原特异性IgE的检测尚无任何的国际标准，由于各个厂家使用的过敏原原料的来源，过敏原结合到载体的方法和检测方法均不同，所以不同的厂家对同一样本的过敏原特异性IgE检测的结果可能会存在差异，尤其是定量的结果之间往往缺乏较好的可比性，Libeer JC 等人31在对比ImmunoCAP、Immulite 和Adcia Centaur三个系统发现，虽然三个产品都是过敏原定量检测系统，但值差异还是很大，花生sIgE的ImmunoCAP值明显高于另外两个产品的值；Park KH等人32在比较ImmunoCAP和Immulite的时候发现，虾的sIgE值的相关系数只有0.643，不同的过敏原相关性差异很大。因此过敏原的标准化亟待解决。
近几年基因组学和蛋白质组学等分子生物学技术的发展从根本上改变了体外诊断技术的水平，并使变态反应学的基础研究和过敏性疾病的临床诊疗获得了长足的进步。用于检测特异性IgE抗体的基因重组过敏原组分蛋白的成功合成使得过敏原组分诊断(Component-Resolved Diagnosis ,CRD)成为可能。最近，CRD已经用于榛子和花生过敏研究，并与DBPCFC结果进行比较，E. Eller&C. Bindslev-Jensen的最近研究显示，其主要过敏原Ara h2蛋白的诊断效能显著优于花生粗提取物，抗Ara h 2特异性IgE>1.63kU/L作为临床相关花生过敏的Cutoff值同时具有较好的敏感度和特异性33；但是Beyer等人研究认为抗Ara h 2特异性IgE在14.4kU/L具有90%的花生激发试验阳性预测值，抗Cor a 14特异性IgE在47.8kU/L具有90%的榛子激发试验阳性预测值34。CRD进一步结合生物芯片技术可为过敏性疾病患者提供更精准快速的sIgE检测结果35。
目前已经有很多常规的检测方法采用过敏原组分蛋白，如在欧洲一些国家，已经有采用天然组分过敏原蛋白用于临床常规SPT检测，如纯化的天然桃子蛋白Pru p 3以及纯化的天然枣子profilin36；Andersson K等人在榛子提取物中掺入Cor a 1.04，大大提高了体外sIgE检出率37，且研究发现，与DBPCFC相比，可以大大提高阴性预测值38。而且也越来越多的常规检测方法开始采用基因重组过敏原组分蛋白代替传统天然纯化过敏原蛋白，Kollmann等人在最近的研究中采用纯化重组Mal d 1和Bet v1及桦树花粉提取物用于皮肤点刺试验，在本研究中，21位患者就有20位患者对50ug/ml浓度的rMal d 1反应阳性，皮肤点刺试验阳性率为95%39；在对奥地利花生过敏患者的研究发现，有症状的患者主要是对Ara h 2和Ara h 6过敏，如果同时伴随有桦木花粉过敏，在Ara h 2特异性IgE阴性的情况下，应该检测Ara h 840；另外研究发现，儿童花生过敏通常是对Ara h 1、2和3过敏，且Ara h 2特异性IgE≥1.0kUA/L与发生花生引起的系统反应显著相关41。
重组过敏原组分蛋白的使用，将使过敏原标准化正逐渐成为可能。
3.3 嗜碱性粒细胞激活试验
在过敏原与IgE发生桥联反应时，人嗜碱性粒细胞的分泌反应激活，这一特点被广泛用于研究，作为过敏原特异性IgE抗体的替代测定方法42-44。但是因为耗时长且价格昂贵，这些方法直到现在也未广泛用于过敏性疾病的诊断。嗜碱性粒细胞激活试验（BAT）是通过加入怀疑的过敏原预孵育然后检测全血中嗜碱性粒细胞的活性。该反应活性可以通过测定释放的组胺（组胺释放试验）或白三烯C4（CAST-ELISA）来体现。在上世纪90年代后期，研究发现嗜碱性粒细胞被过敏原激活后，许多表面蛋白表达增加，如CD45，CD63，CD69和CD203c45-47，可以通过流式细胞仪检测到这些蛋白，从而使嗜碱性粒细胞激活试验取得了新的发展48。
近年来，全球过敏性疾病的发病率逐渐增高，过敏原sIgE检测是过敏性疾病诊治的最重要的环节之一，随着基因组学和蛋白组学等学科的飞速发展，新的过敏原sIgE检测方法的不断涌现，传统方法的灵敏度和准确度得到进一步提高，过敏原sIgE检测正呈现大通量，标准化的趋势，从而进一步推动过敏性疾病的防治技术的不断进步。
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